G家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 30972411)資助的課題
*通訊作者。Tel: 010-62336062, E-mail: chbly@sohu.com
Received: November 3, 2012   Accepted: January 5, 2013
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.30972411)
*Corresponding author. Tel: +86-10-62336062, E-mail: chbly@sohu.com
 
 
超低溫保存(cryopreservation)是指將生物材料活體, 采取一定的技術(shù), 存入–80 ℃以下的低溫保存(通常為液氮–196 ℃), 需要時(shí)采取一定的方法使之回到常溫并正常生長(zhǎng)的一整套生物技術(shù)。由于在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及食品等相關(guān)*域有著廣泛的應(yīng)用前景, 超低溫保存已成為近年來(lái)低溫生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一^[1]。近年來(lái), 超低溫保存的技術(shù)研究已趨于成熟, 除了基于低溫脫水的傳統(tǒng)的超低溫保存技術(shù)外, 新興的基于細(xì)胞內(nèi)部溶質(zhì)玻璃化的超低溫保存技術(shù)的發(fā)展, 極大地?cái)U(kuò)充了超低溫保存的應(yīng)用范圍^[2]。超低溫保存技術(shù)的發(fā)展依賴于其機(jī)制的解答, 而機(jī)制的解答也會(huì)起到指導(dǎo)超低溫保存技術(shù)發(fā)展的作用。但是, 就目前的現(xiàn)狀而言, 超低溫保存的機(jī)制研究相對(duì)滯后, 這也在一定程度上限制了超低溫保存技術(shù)應(yīng)用范圍的進(jìn)一步擴(kuò)大。
近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn), 在超低溫保存中往往伴隨著氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡兩大生理現(xiàn)象, 這些現(xiàn)象是否與超低溫保存密切相關(guān), 是否會(huì)影響超低溫保存的效果, 是否可以作為改進(jìn)超低溫保存技術(shù)的依據(jù), 這些問(wèn)題也逐漸得到了研究者的關(guān)注。本文對(duì)近二十年來(lái)超低溫保存中與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡兩大生理現(xiàn)象相關(guān)的研究做出綜述, 以期為推進(jìn)超低溫保存技術(shù)的進(jìn)步提供理論依據(jù)。

1 超低溫保存中的氧化應(yīng)激現(xiàn)象

氧化應(yīng)激是指由于活性氧(reactive oxygen species, ROS)過(guò)度產(chǎn)生和抗氧化防御機(jī)制減弱, 導(dǎo)致活性氧的生成和清除之間的平衡失調(diào), 過(guò)量的活性氧引起分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷^[3-7]。諸多的研究發(fā)現(xiàn), 超低溫保存往往伴隨著生物材料中活性氧水平的升高, 而過(guò)多的活性氧引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致生物材料超低溫保存損傷的重要原因之一。理論表明, 當(dāng)活性氧的生成量大于細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)水平時(shí), 過(guò)多的活性氧就會(huì)攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或核酸等大分子, 通過(guò)去除電子的方式, 促使其結(jié)構(gòu)的修改和功能的改變, 從而導(dǎo)致脂質(zhì)的過(guò)氧化、蛋白質(zhì)的變性以及DNA或 RNA的損傷^[8-10]。
Baumber^[11]對(duì)馬精子的超低溫保存研究發(fā)現(xiàn), 高水平活性氧的生成會(huì)增加DNA的片段化和減少谷胱甘肽的生成量, 并認(rèn)為活性氧可能與精子獲能的信號(hào)通路相關(guān)。這與Meseguer等^[12]的發(fā)現(xiàn)存在一定的一致性——谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1和4的表達(dá)水平及活性、谷胱甘肽濃度與人類精子超低溫保存后的恢復(fù)速率相關(guān),。Li等^[13]同樣在人類精子的超低溫保存中發(fā)現(xiàn), 保存后活性氧的生成量顯著上升, 并且與凍融后精子的生存力和運(yùn)動(dòng)性下降等變化呈現(xiàn)出相關(guān)性, 因此認(rèn)為超低溫保存后精子質(zhì)量的下降可能是由氧化應(yīng)激所造成的。Zribi等^[14]在人類精子的超低溫保存中也發(fā)現(xiàn)了保存后精子的DNA片段化和氧化率顯著增加的現(xiàn)象, 但并未對(duì)其產(chǎn)生機(jī)制做出解釋。Thomson等^[15]以8-羥化脫氧鳥苷(8-OHdG)作為生物標(biāo)記, 證明了超低溫保存引起的人類精子DNA片段化與氧化應(yīng)激相關(guān)。
生物材料中活性氧的種類包括了激活的單電子氧(¹O₂)、超氧陰離子自由基(·O₂^–)、過(guò)氧化氫(H₂O₂)和羥基自由基(·OH)等^[16]。目前的研究顯示, 與超低溫保存相關(guān)的氧化應(yīng)激可能是由羥基自由基所主導(dǎo)的。Fang等^[16]在研究中發(fā)現(xiàn), 超低溫保存后伴隨著可可體細(xì)胞胚的恢復(fù), 羥基自由基產(chǎn)生的揮發(fā)性碳?xì)浠衔?mdash;—甲烷, 呈現(xiàn)出一定的周期性變化規(guī)律。更確鑿的證據(jù)來(lái)自于Góes等^[10]的研究, 他們將超低溫保存后的山羊精子培養(yǎng)在4種不同的活性氧誘導(dǎo)機(jī)制下(分別產(chǎn)生激活的單電子氧、超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫和羥基自由基), 精子對(duì)羥基自由基顯示出了高敏感性。
為了減少或消除氧化應(yīng)激的影響, 抗氧化劑在超低溫保存中得到了廣泛的應(yīng)用。抗氧化劑可以轉(zhuǎn)換活性氧, 防止其過(guò)剩, 從而**大限度地提高超低溫保存后細(xì)胞的存活率^[17]。在眾多的抗氧化劑中, 過(guò)氧化氫酶經(jīng)常作為冷凍和熔融過(guò)程中的添加劑使用。研究表明, 添加過(guò)氧化氫酶可以顯著減少超低溫保存后人類精子^[13]和馬精子^[11]的活性氧的生成量, 提高家貓精子的運(yùn)動(dòng)性和前向性^[8], 并改善人類造血干細(xì)胞的粘附性和與遷移有關(guān)的屬性等^[18]。此外, 過(guò)氧化物歧化酶^[8]、依達(dá)拉奉^[19]、維他命E、維他命C、谷胱甘肽、硫辛酸、甜菜堿^[9]、抗壞血酸^[13]、蛋氨酸、肌醇、肉堿^[20]等物質(zhì)也被作為抗氧化劑應(yīng)用于超低溫保存中。**新的研究還顯示, 精漿對(duì)于解凍后馬精子^[11]和山羊精子^[10]的恢復(fù)更為有效: 而血小板裂解物對(duì)超低溫保存后人類肝臟細(xì)胞代謝功能的恢復(fù)更為有效^[21]。這可能同樣是與精漿和血小板裂解物中含有抗氧化性的物質(zhì)相關(guān)。
此外, 針對(duì)細(xì)胞膜的研究顯示, 超低溫保存會(huì)造成細(xì)胞膜的大范圍破壞, 因此往往將細(xì)胞膜的完整性作為成功的超低溫保存的**低標(biāo)準(zhǔn)^[22]。如前所述, 氧化應(yīng)激是造成超低溫保存中生物材料損傷的重要原因之一?；钚匝鹾苋菀籽趸ぶ系牟伙柡椭舅帷Ｖ|(zhì)的過(guò)氧化一方面改變了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能, 例如通透性的升高, 另一方面它會(huì)導(dǎo)致二次脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物如醛的生成, 而醛分解后的丙二醛(MDA)又會(huì)與蛋白質(zhì)、酶類和DNA鏈接, 進(jìn)一步導(dǎo)致潛在的誘變^{[9, 16, 17]}。
Martinez等^[23]在甘蔗胚性愈傷組織超低溫保存后的第2天觀察到了電導(dǎo)率的升高。尚曉倩^[24]在芍藥花粉的超低溫保存中觀察到電導(dǎo)率隨保存時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)上升: 而李廣清^[25]在山茶花粉的超低溫保存中發(fā)現(xiàn)花粉電導(dǎo)率是前期升高, 后期有出現(xiàn)下降趨勢(shì), 但仍高于對(duì)照。這些研究都說(shuō)明超低溫保存確實(shí)在一定程度上對(duì)細(xì)胞膜造成了損傷, 從而導(dǎo)致了細(xì)胞外電解質(zhì)滲透液的增加。除了使用電導(dǎo)率作為細(xì)胞膜通透性的參數(shù)外, 脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物丙二醛(MDA)也被用來(lái)作為檢驗(yàn)超低溫保存效果的指標(biāo)。超低溫保存后, 山茶花粉^[25]、蠟梅花粉^[26]、木薯莖尖^[27]、羅氏沼蝦胚胎^[28]、留蘭香莖尖^[29]等的MDA含量均顯著升高。超低溫保存中氧化應(yīng)激及外源抗氧化劑關(guān)系的研究進(jìn)展見圖1。
 
圖1  超低溫保存中氧化應(yīng)激及外源抗氧化劑作用
Fig.1  Effect of antioxidants to the pro-oxidant/antioxidant balance in the cryopreservation
 
除了以上脂質(zhì)過(guò)氧化的間接證據(jù)外, 研究者還證明了超低溫保存對(duì)細(xì)胞膜脂類成分變化的直接影響。Blesbois等^[30]發(fā)現(xiàn)超低溫保存導(dǎo)致火雞和珍珠雞精子的細(xì)胞膜膽固醇/磷脂的比例顯著下降, 并認(rèn)為這種變化降低了細(xì)胞膜的流動(dòng)性。Chakrabarty等^[31]在山羊精子的超低溫保存中發(fā)現(xiàn), 總脂及其組成成分的中性脂肪、糖脂和磷脂在超低溫保存后下降明顯, 其中與磷脂相關(guān)的不飽和脂肪酸比例變小, 而飽和脂肪酸比例上升, 因而認(rèn)為山羊精子應(yīng)對(duì)超低溫?fù)p傷的主要機(jī)制是通過(guò)優(yōu)先脫落細(xì)胞膜中親水性的脂質(zhì)成分而增加細(xì)胞膜的疏水性進(jìn)行的。Odintsova等^[32]對(duì)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲細(xì)胞的研究顯示, 超低溫保存極大地影響了細(xì)胞膜脂肪酸的飽和度、單烯度和多烯度, 并且這種變化因保存的細(xì)胞來(lái)源和使用的冷凍保護(hù)劑而存在差異。
鑒于以上研究, 相應(yīng)的細(xì)胞膜保護(hù)措施也被應(yīng)用于超低溫保存中, 其中通過(guò)一定的方式來(lái)增加膽固醇和不飽和脂肪酸的含量是采取的主要方式。已證明, 外援膽固醇的添加可以顯著改善牛精子^[33]和馬精子^[34]超低溫保存后的存活率: 而Ω-3脂肪酸可以顯著提高超低溫保存后不飽和脂肪酸的含量^[35]。此外, 還有研究發(fā)現(xiàn), 蔗糖的預(yù)培養(yǎng)可以使香蕉懸浮細(xì)胞超低溫保存后豆甾醇/甾醇的比例, 總脂肪酸中的中性脂質(zhì)、糖脂和鞘脂的成分以及游離脂肪酸酸含量顯著增高, 并使中性脂肪的雙鍵指數(shù)增加以及糖脂和鞘脂、磷脂和游離脂肪酸的雙鍵的減少, 并提高了超低溫保存后的存活率^[36]。而利用毛猴素進(jìn)行化學(xué)去脂, 可以顯著提高貓胚胎超低溫保存后的存活率、桑椹胚和胚泡的形成率^[37]。這些保護(hù)措施可能都與改變細(xì)胞膜脂類成分的含量相關(guān)。

2 超低溫保存中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

超低溫保存造成的細(xì)胞死亡主要有以下三種類型: 細(xì)胞破裂(與冰晶生成有關(guān))、細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡^[38]。部分研究發(fā)現(xiàn), 超低溫保存造成的細(xì)胞死亡具有遲發(fā)性, 進(jìn)一步研究遲發(fā)性死亡的背后機(jī)制顯示, 這種死亡主要是由細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡這兩種途徑所造成的^[39]。其中, 區(qū)別于細(xì)胞壞死的被動(dòng)過(guò)程, 細(xì)胞凋亡作為一種與能量相關(guān)的, 由基因控制的細(xì)胞**、有序的死亡方式, 得到了超低溫保存機(jī)制研究者的廣泛關(guān)注。
細(xì)胞凋亡通常會(huì)采用半胱氨酸蛋白酶活力、磷脂酰絲氨酸的外化、線粒體膜電位的改變和DNA片段化等參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)^[40]。Paasch等^[41]比較了超低溫保存對(duì)人類精子細(xì)胞凋亡參數(shù)的影響, 發(fā)現(xiàn)超低溫保存后, 半胱氨酸蛋白酶-3、-8和-9的活性顯著上升, 線粒體膜電位下降, 但DNA片段不存在顯著變化。Martin等^[42-43]同樣在超低溫保存后的牛精子中發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位的降低、半胱氨酸蛋白酶活性和細(xì)胞膜通透性升高等現(xiàn)象, 并檢測(cè)到了細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子這兩種伴隨細(xì)胞凋亡的蛋白的產(chǎn)生, 但沒有發(fā)現(xiàn)DNA片段化和細(xì)胞核濃縮的顯著變化。Vogel^[44]通過(guò)免疫印跡技術(shù)比較了人類真皮的成纖維細(xì)胞中線粒體蛋白質(zhì)Bcl-XL和Bax的比值(這兩種蛋白的比值代表了細(xì)胞凋亡正向和負(fù)向的比例), 發(fā)現(xiàn)在超低溫保存復(fù)溫后比值略有升高, 在之后的6小時(shí)和12小時(shí)顯著上升, 直到24小時(shí)才恢復(fù)到與對(duì)照相當(dāng)?shù)乃?。Liu等^[45]在比較超低溫保存前后的小鼠卵巢卵泡的基因組時(shí), 發(fā)現(xiàn)超低溫保存誘導(dǎo)了凋亡基因Fas和Fas配體的表達(dá)。Park等^[46]同樣證明了凍融過(guò)程引起了牛囊胚細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的生存素、Fas、熱休克蛋白70和半胱氨酸蛋白酶-3基因表達(dá)量的增加。
以上研究在證明超低溫保存與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性之外, 也為如何減輕或消除細(xì)胞凋亡的影響指明了道路。半胱氨酸蛋白酶抑制劑已被證明在豬肝細(xì)胞超低溫保存中降低了半胱氨酸蛋白酶-3的活性、減少線粒體中細(xì)胞色素C的釋放, 減慢線粒體膜電位的下降速度, 并使肝細(xì)胞活力的功能指標(biāo)——白蛋白產(chǎn)量、地西泮的代謝和尿素產(chǎn)量顯著增加^[47]。而在大鼠的肝細(xì)胞超低溫保存中, 添加半胱氨酸蛋白酶抑制劑則顯著改善了復(fù)溫后6小時(shí)和24小時(shí)的肝細(xì)胞的分化能力和功能^[48]。
氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡作為近年來(lái)超低溫保存中生理現(xiàn)象的兩大研究熱點(diǎn), 其本身也存在著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。研究表明, 超低溫保存中出現(xiàn)的氧化應(yīng)激不僅可以直接造成細(xì)胞損傷, 也可能誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡, 如活性氧活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB(nuclear factor-Kappa B, NF-kB), 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡; 或通過(guò)作用于線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡; 活性氧導(dǎo)致DNA損傷, 激活P53, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及ROS激活SAPK通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等^[49]。
圖2所示線粒體產(chǎn)生的活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡, 可以在一定程度上反映超低溫保存中細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激的關(guān)系。
 
圖2  由線粒體產(chǎn)生的活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡示意圖(根據(jù)參考文獻(xiàn)[50]修改)
Fig.2   Schematic representation of apoptosis which is mediated by ROS generated by mitochondria(modified from reference [50])

3 結(jié)語(yǔ)和展望

超低溫保存中有關(guān)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡兩大生理現(xiàn)象的研究還處于起步階段, 本質(zhì)的揭示尚需要大量的實(shí)驗(yàn)支持。對(duì)超低溫保存中氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡這兩大生理現(xiàn)象廣泛和深入研究, 不僅對(duì)揭示超低溫保存機(jī)制有重要的理論意義, 也將為超低溫保存技術(shù)發(fā)展提供一條新的思路。
圍繞該研究方向, 未來(lái)的超低溫保存研究將集中在超低溫保存技術(shù)中探索更多的抗氧化劑(包括酶類和非酶類)的使用效果, 從而開發(fā)新型的保護(hù)劑; 超低溫保存的技術(shù)策略也會(huì)更多通過(guò)防止細(xì)胞膜氧化, 而不是僅僅關(guān)注冰晶對(duì)細(xì)胞膜的傷害展開; 超低溫引起細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑及其阻斷技術(shù)也會(huì)得到深入的研究, 從而提高超低溫保存材料的成活率。
 
 

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